日前，FDA 与基因治疗相关企业刚刚结束了马拉松式咨询委员会会议，会议的核心围绕 AAV 基因治疗的安全性展开，这一问题一直是基因治疗中的一道 “必答题”。
美东时间 9 月 9 日，来自博德研究所和哈佛大学的研究人员开发了一种新型的 AAV 靶向疗法，能够逆转小鼠体内的肌营养不良症症状。相关研究成果已发表在 Cell 杂志上。Mohammadsharif Tabebordbar（也叫 Sharif Tabebordbar）是该研究的第一作者兼通讯作者。
在这项研究中，他们在小鼠和灵长类动物体内定向进化出一种工程化改造的 AAV 载体 —— MyoAAV，研究显示这种载体能够高效靶向肌肉组织，递送到肌肉组织的效率是传统病毒载体的 10 倍以上。同时，与传统递送载体相比，该载体在遗传性肌肉疾病中的治疗剂量降低大约 100 到 250 倍，可有效降低肝毒性等副作用。
研究人员还表示，计划将这种工程化递送载体技术发展为平台化技术，扩展到更多组织器官，以治疗多种疾病。
（来源：Cell）
为父亲做一些力所能及的事情
在十几岁时，Tabebordbar 的父亲患上了肌营养不良症，与病魔斗争中，他的父亲变得越来越虚弱，最终无法独立行走，坐上了轮椅。自那时起，Tabebordbar 开始寻求开发一种针对罕见肌肉疾病更好的基因疗法，为自己的父亲做一些力所能及的事情。
肌营养不良症是一种由于负责肌肉功能的基因缺陷所导致的遗传性疾病，患者常常表现为肌肉损伤、骨骼肌萎缩和无力等。
以 CRISPR/Cas9 为代表的基因编辑技术是治疗遗传性疾病的革命性方法，这种方式理论上能够从源头上解决遗传疾病问题。但是，肌营养不良症的基因疗法一直面临着许多障碍，包括如何将基因疗法有效递送到全身肌肉中。
图 | Sharif Tabebordbar 一家正在哈佛大学庆祝，左一为 Sharif Tabebordbar（来源：hhmi）在哈佛大学攻读硕士学位时，他在小鼠身上开发了可以治疗杜氏肌营养不良症的基因疗法。获得博士学位后，他加入了基因编辑疗法公司 Editas Medicine，开始将基因疗法应用于人体试验中，递送载体选择了最常用病毒载体 AAV。在这期间，他发现大多数递送的基因片段都滞留在肝脏中，很少进入肌肉组织中，同时进入肝脏的大量病毒载体也可能会引发相应的肝毒性。
Tabebordbar 意识到需要开发一种更好的病毒载体，将基因片段精准递送到肌肉组织中。“AAV 是基因治疗的递送工具，这种工具需要经过进化和改造。”Tabebordbar 在接受外媒采访时说。
病毒本身能够通过进化更有效地靶向宿主细胞，Tabebordbar 决定利用病毒自然进化的能力，开发出一种可以靶向肌肉的病毒载体。
于是，Tabebordbar 加入到了哈佛大学霍华德休斯医学研究所研究员 Pardis Sabeti 实验室，Pardis Sabeti 是该项研究的通讯作者。她是计算遗传学家，哈佛大学系统生物学和有机进化生物学中心的教授，同时也是 SHERLOCK Biosciences 的联合创始人。其实验室的工作主要集中于自然选择对人类基因组和其他生物基因组的影响，揭示塑造这些物种的特征，并理解人类和病原体的进化适应机制。
图 | Pardis Sabeti在 Pardis Sabeti 实验室，Tabebordbar 与同事共同发现了一种更具有潜力的 AAV 家族，能够特异性靶向肌肉和心肌细胞。具体来说，他们将这些病毒注射到了老鼠和猴子体内，然后跟踪检测哪些病毒能最能精准靶向肌肉细胞。不断重复这个过程指导 AAV 进化，直到筛选出只需要以往百分之一剂量即可有效实现基因治疗的病毒载体 —— 也就是上文提到的 MyoAAV 载体。
这项研究也是 Tabebordbar 近 10 年在基因疗法领域研究工作的积累。
靶向性更强、剂量更低
AAV 低剂量转染细胞的效率不够，可能看不到治疗效果；而高剂量免疫原性高，以及转染不均一，增加了 AAV 基因治疗的安全性风险。归根结底，基因药物的有效性浓度窗口难以确认。因此，找到安全有效的剂量范围是基因治疗的一大关键。
修饰 AAV 的衣壳是提高病毒载体安全性和有效性的一种手段。该团队使用了称之为 “利用转基因 RNA 体内表达的 AAV 衣壳定向进化”(directed evolution of AAV capsids leveragingin vivo expression of transgene RNA，DELIVER) 的方法修饰衣壳，从而筛选并制造出 MyoAAV。
Tabebordbar 指出，该系统可以在不同的动物模型中筛选数百万种衣壳亚型，并选择能有效将遗传片段靶向到相关宿主细胞的亚型。
在定向进化过程中，该团队首先选择了 AAV9，这是临床上常用的一种基因治疗载体，诺华获批的 SMA 基因疗法 Zolgensma 就采用了 AAV9，这款药当前全球最昂贵的药物。再将氨基酸片段添加到天然存在的衣壳中，将衣壳注射到小鼠和猴子体内，并对动物的肌肉组织进行追踪检测，挑选出能够成功转导该基因的衣壳。
（来源：Cell）
然后挑选了在肌肉组织中高表达的衣壳 MyoAAV 1A 进一步测试。Tabebordbar 指出，在小鼠中，注射 MyoAAV 1A 导致骨骼肌中荧光蛋白的转基因表达比注射 AAV9 的小鼠高了 10 到 29 倍。与 AAV9 相比，进入肝脏的 MyoAAV 1A 数量较少；与注射 AAV9 的动物相比，注射了 MyoAAV 1A 的动物肝脏中转基因的表达较低。
在杜氏肌营养不良症小鼠模型中，他们还发现，MyoAAV 1A 在肌肉组织中恢复了靶向的肌营养不良蛋白，治疗效果也比 AAV9 方法更好。
研究人员还指出，研究中所使用的剂量比安斯泰来 AAV8 基因疗法 AT132 临床试验中采用的剂量低了 100 倍。
“与野生型衣壳相比，MyoAAV 只需极低的剂量就可以达到同样的治疗效果，最重要的是，这类衣壳病毒不会在肝脏中停留，”Tabebordbar 说，“这两个特性使 MyoAAV 衣壳家族具有克服肝毒性问题的优势。”
新衣壳 “似乎具有两全其美的优势，既能够更精准进入肌肉，又降低了停留在肝脏中的情况。”Chamberlain 说，他于 2004 年首次报告了将 AAV 基因疗法递送到全身肌肉。
随后，研究团队深入分析了 MyoAAV 1A ，发现它的转导依赖于细胞表面的整合素，并基于此修改了 MyoAAV 1A 上的氨基酸，利用 DELIVER 筛选第二代变体 ——MyoAAV 2A 。与 AAV9 相比，MyoAAV 2A 在小鼠肌肉组织中递送的 AAV 基因组数量高 12 到 46 倍，但在肝脏中的含量低 2.5 倍。
正在推进转化工作，或可应用于“任何”组织
MyoAAV 载体在动物试验中的表现，也增加了 Tabebordbar 将该研究成果推向转化的信心。“我们团队现在正在寻找产业界合作伙伴，将 MyoAAV 类衣壳推向临床试验中。”
肌营养不良症的基因治疗必须克服临床试验中可能出现的其他挑战，比如如何避免免疫原性和有效进入肌肉干细胞。尽管如此，Tabebordbar 仍然认为改进后的递送系统 “非常有前景”。
研究人员在一份声明中写道，“这些载体有可能推动基因治疗应用于大量肌肉骨骼疾病中。”
“更广泛地说，通过在目标组织或细胞类型中表达转基因的变体，DELIVER 可以帮助病毒载体进化衣壳并靶向任何相关的细胞类型，”Tabebordbar 说，他认为 DELIVER 平台技术的潜力并不局限于肌肉疾病。
图 | Sharif Tabebordbar 博士（来源：broadinstitute）“看到这些病毒如何巧妙地适应特定的细胞类型，真是太神奇了。”Pardis Sabeti 说。
研究人员预计，把 DELIVER 应用于其他组织和器官中，会对加速基因治疗和其他基因组疗法的开发和转化产生深远影响，并有潜力治疗多种疾病。
另一方面，该团队还指出，较低的剂量要求也可以降低基因治疗的成本。
