国自然必引系列：组蛋白修饰原来这么多花样

组蛋白(Histones)是一种小的碱性蛋白质，人们最初认为组蛋白是一种包装蛋白，因为它们负责压缩和主装DNA成为染色体的结构单元核小体。组蛋白翻译后修饰在所有需要DNA参与的过程发挥重要作用，包括转录、复制和修复，也对染色质结构有影响。随着研究的进展，研究者发现它们也具有强大的抗菌特性，并阐明了组蛋白发挥抗菌活性的作用机制。由于研究发现组蛋白作为中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps,Nets)中最丰富的蛋白质，因此不仅组蛋在天然免疫中的作用备受关注，而且研究的目光也聚焦于胞外组蛋白如何对宿主产生影响。

今天给大家分享一篇发表在Clinical Biochemistry上“A focus on the roles of histones in health and diseases”关于组蛋白的综述文献，主要介绍组蛋白的结构、在先天性免疫以及在病理过程中的作用，并对组蛋白作为潜在生物标志物和治疗药物的应用前景进行了讨论。

组蛋白的结构

每条染色体上的双螺旋分子DNA可跨越细胞核数千次。组蛋白在将DNA分子装入细胞核的过程中起至关重要的作用，因为它们富含碱性氨基酸，使它们与DNA具有亲和力，从而形成了一种组织良好的复合体，称为染色质。染色质的基本单位是核小体，核小体由147个碱基对的DNA盘旋在两分子的H2A、H2B、H3和H4组成的核心八聚体复合体外面，另外两种组蛋白H1和H5充当相邻核小体的连接物，它们通过在DNA双链开口处与相邻的核小体结合以保护DNA。此外，核小体还参与了更高级染色质结构(30nm)的形成（图1）。根据其氨基酸组成，组蛋白可分为两类：富含赖氨酸(H1、H2A和H2B)和富含精氨酸(H3和H4)。

图1

细胞核内DNA 紧密排列形成染色体，染色体由染色质纤维组成。染色质的基本单位是核小体，它由组蛋白复合物包裹在DNA 周围形成，相邻的核小体由组蛋白H1/H5连接。

组蛋白和DNA都可以发生翻译后修饰(post-translational modifications，PTMs)从而影响染色质和DNA的结构，决定DNA 特定区域的折叠和展开状态。这些翻译后修饰通常位于核心组蛋白的N末端尾域，其他修饰也可能发生在组蛋白球状结构域中，调节转录因子对DNA的结合、基因表达（如DNA重组、修复和复制）、染色质结构和基因组稳定性。组蛋白可发生多种PTM，例如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化或瓜氨酸化。其中，研究最多的是调控基因表达的核心组蛋白甲基化和乙酰化。例如，组蛋白N-末端赖氨酸残基的乙酰化促进了染色质的解聚，提高DNA转录活性，而组蛋白的去乙酰化导致转录沉默；组蛋白磷酸化参与了许多过程，如转录、DNA修复、细胞周期、凋亡和染色体聚合；组蛋白泛素化在DNA转录、染色质结构维持和DNA修复中起关键作用；组蛋白的瓜氨酸化也称为脱亚胺化，是通过肽基精氨酸脱亚胺酶家族（peptidyl arginine deiminases, PAD）催化，将精氨酸残基转化为瓜氨酸的过程，特别是由PAD-4亚型介导是形成NETs的关键步骤，NETs是对抗微生物病的主要免疫武器，被称为NETsis，其抗菌机制为细胞外间隙中的中性粒细胞激活后通过释放网状纤维NETs，从而捕获和杀灭病原体，NETs结构是以DNA为基本结构附着大量蛋白。组蛋白占所有NET相关蛋白的70%，其余的主要抗菌活性较强的蛋白质组成，如弹性蛋白酶(NE)和髓过氧化物酶(MPO)。

组蛋白的免疫学功能

已有研究表明组蛋白和组蛋白衍生的抗菌肽在先天免疫反应和炎症中都起着关键作用。几项研究证实从不同物种动物获得的不同类别的组蛋白对细菌、真菌、寄生虫甚至病毒都显示出广泛的抗菌作用。

不同类型的细菌对组蛋白有防御机制，例如通过分泌蛋白酶结合或降解组蛋白。研究表明组蛋白是NETs中最丰富的蛋白质，具有强大的杀菌功能。按作用机制分类，组蛋白发挥抗菌活性可为两大类：对膜通透性和转录中DNA的结合/破坏转录的影响。然而，这些结论大多是来源于分析组蛋白来源的抗菌肽而不是全组蛋白。蟾蜍肽II是一种首次从蟾蜍物种中分离出来的肽，它与H2A的一段序列完全相同，其杀菌机制被发现依赖于穿透细菌细胞膜和DNA结合；经细菌外膜蛋白酶T消化产生的H2B的N末端结构域的一种肽，可穿透大肠杆菌的细菌细胞膜，继而抑制其功能。而虹鳟鱼皮肤分泌物中的H1衍生多肽Oncorhyncin II需要进入细胞与核酸的结合才能发挥抗菌作用。H3和H4的抗菌作用依赖于膜蛋白酶T，通过破坏细菌膜特性发挥抗革兰氏阴性细菌作用。

关于组蛋白抗病毒的研究甚少，但也有研究表明组蛋白能发挥抗病毒活性。例如H2B在作为人胞浆传感器，在病毒感染期间识别异常的dsDNA激活抗病毒途径，抑制病毒复制；H1C通过调节干扰素β反应影响流感病毒的复制。然而，由于副作用，体内组蛋白的抗病毒活性可能不会出现。

组蛋白对宿主细胞的损害

由于组蛋白对细胞膜磷脂等带负电荷的大分子的亲和力高，所以细胞外组蛋白对周围组织产生不同的影响。通过研究实验模型和人类疾病发现，在某些条件下，细胞外组蛋白也可以对宿主细胞产生有害影响，包括内皮损伤和生理过程的失调，如炎症、凝血激活和中性粒细胞胞外陷阱形成，具体取决于细胞类型（图2）。在小鼠模型中发现，外源性组蛋白会刺激中性粒细胞迁移、内皮损伤和功能障碍、出血和血栓形成，最终导致动物死亡。

体外研究表明，组蛋白对内皮细胞发挥直接的细胞毒性作用，促进其活化并诱导程序性细胞死亡，如自噬、细胞凋亡和焦亡，从而导致炎症和/或促凝血过程。除了诱导内皮活化外，细胞外组蛋白还可以通过其他机制引发炎症和促凝。关于它们在炎症中的作用，细胞外组蛋白可充当损伤相关分子模式(DAMP)。细胞外组蛋白通过Toll 样受体 (TLR) 2、TLR 4 以及 TLR 9信号传导可激活和募集多形核中性粒细胞（Polymorphonuclear Neutrophil，PMN）和单核细胞/巨噬细胞，产生细胞内氧化剂并触发IL-6、TNF-α、CXCL9 和 CXCL10等促炎因子的分泌。然而，有研究表明细胞外组蛋白的促炎作用并不总是依赖于特定的信号通路，可以通过直接的细胞毒性发挥作用。体外研究发现，外化的H4通过膜通透性直接刺激中性粒细胞活化从而引发平滑肌细胞坏死，促进细胞内容物的释放，最终导致慢性炎症。

图2

（a）蛋白通过翻译后修饰(PTM)被不断修饰，导致DNA特定区域的折叠和展开，在染色质表达和染色体稳定性的调节中起着关键作用。(b)组蛋白对广泛的细菌、真菌、寄生虫甚至病毒都有抗菌作用。可能涉及两种不同的作用机制：对膜通透性的影响和DNA结合/扰乱转录。(c)胞外组蛋白通过Toll样受体（TLR2/4/9）信号通路，与细胞膜磷脂的高亲和力结合而激活，充当损伤相关分子模式（DAMPs）参与细胞损伤。(d)中性粒细胞胞外陷阱（NET）失调导致组蛋白释放加剧，可能导致内皮损伤、炎症、血小板活化、凝血功能增强和血栓形成。

细胞外组蛋白可参与不同器官炎症的发生或发展。研究发现，与对照组相比，慢性阻塞性肺疾病患者肺组织细胞外间隙、气道腔粘膜、支气管肺泡灌洗液和血浆中的H3.3水平显著升高。小鼠急性肝功能衰竭模型发现，组蛋白的释放与濒临死亡的肝细胞或炎性白细胞相关，表明组蛋白进入血液循环可能会引发和放大炎症。细胞外组蛋白可以激活Kupffer细胞中NLRP3炎症小体介导的炎症途径，触发先天免疫反应和随后的免疫细胞浸润，激活活性氧的介质和增加炎性细胞因子的产生从而导致肝损伤。据报道，细胞外组蛋白H4与平滑肌细胞结合后促进其裂解，引发动脉组织损伤和炎症，导致动脉粥样硬化斑块不稳定。抗组蛋白抗体在脓毒症、缺血后脑、肝和肾损伤小鼠模型中显示出保护作用，表明细胞外组蛋白可诱发炎症和损伤。

Brill 等人发现静脉输注组蛋白促进了小鼠静脉血栓栓塞 (venous thromboembolism，VTE)。具体机制为：H3和H4组蛋白通过TLR2和TLR4，诱导单核细胞和内皮细胞中的组织因子（TF）的表达和下调血栓调节蛋白 (TM)水平，促进血小板聚集，导致血栓扩散和血小板减少。进一步地，H3和H4通过抑制TM依赖性蛋白C的活化来增加血浆凝血酶的生成，H4还可直接结合红细胞诱导其内膜酸性磷脂酰丝氨酸外化，促进凝血酶原酶复合物介导的凝血酶原激活和血浆中纤维蛋白的形成。另一方面，组蛋白作为NETs的组成部分，可以刺激血小板聚集，甚至可以粘附在NETs上，作为血栓支架，募集血小板、红细胞和参与凝血的效应蛋白。

组蛋白作为潜在的生物标志物和治疗靶点

由于胞外组蛋白发挥上述作用，尤其是在炎症和血栓中起着关键的病理生理作用。因此，胞外组蛋白不仅成为炎症、肿瘤潜在生物标志物，也是治疗靶点。

脓毒症是一种由感染引起的综合征，其特征是免疫反应紊乱，主要特征是炎症和血栓形成。与健康人相比，脓毒症患者循环中的组蛋白显著升高，并且与心肌肌钙蛋白T水平呈线性相关；多重创伤ICU患者的组蛋白H4水平显著高于健康人和轻微创伤且无感染的ICU患者，表明组蛋白作为脓毒症预后不良的生物标志物的潜力。此外，结肠癌患者血浆中组蛋白H4水平水平升高，有助于区分结肠癌与其他疾病，包括正常结肠、癌前息肉和憩室疾病。在系统性红斑狼疮、小血管炎等自身免疫性和自身炎症性疾病中，NETs释放显著增加。此外，与健康对照组相比，新冠肺炎患者的NETs标记物水平升高。

H3瓜氨酸化水平(H3cit) 可作为晚期癌症的生物标志物，并预测癌症患者静脉血栓栓塞(VTE)的发生率和死亡率，此外，高水平的H3cit显著增加了胰腺癌、肺癌和乳腺癌患者患静脉血栓栓塞的风险，其敏感性和特异性可与著名静脉血栓栓塞生物标志物（D-二聚体和可溶性P选择素）媲美。据报道，H3可在中度和进展性/重度新冠肺炎患者的血清样本中检测到，而在轻度患者中检测不到。但是，H3cit和NETs对新冠肺炎患者预后的预测价值还需要进一步的研究。

由于组蛋白带正电，它们可能会被肝素(一种带正电的蛋白多糖)中和。研究已证实肝素能有效阻止组蛋白介导的细胞毒性，并提高脓毒症大鼠的存活率，降低脓毒症患者28天的死亡率。体外试验证实内皮表面蛋白p33与受损内皮细胞释放的组蛋白相互作用，能完全中和红细胞和内皮细胞的溶解和血小板聚集，提高接受致死剂量组蛋白的小鼠存活率。此外，C反应蛋白(CRP) 抑制组蛋白诱导的血小板聚集和凝血激活，可减少肺水肿、出血和血栓形成。Hsieh等人证明了CRP和表面活性蛋白D(SP-D)具有与组蛋白H4结合的能力，可能是对甲型流感病毒感染引起的过度炎症的保护性反应。

综述结论

在这篇综述中，作者阐述了组蛋白的细胞内结构，总结和讨论了细胞外组蛋白参与免疫/炎症反应，证实了组蛋白细胞外的作用可能是有益的，也可能是有害的，它可作为许多疾病的潜在生物标志物和治疗靶点。作者认为进一步的研究应该集中在：①与目前使用的疾病生物标志物相比，组蛋白是否有助于提高风险预测；②何时是测量组蛋白的合适时机、是否应该在不同的时间监测组蛋白水平以评估疾病进展；③证明中和细胞外组蛋白的药物(如抗体、CRP、SP-D、p33、肝素)在体内是否能抑制组蛋白毒性效应。