学技巧：单基因文章如何选基因_

相比于各色各样的诊断预后模型，很多人更钟爱与单基因文章思路。因为单基因文章思路更加简单，从一个点扩散出去，研究其各项特征，表达分布，遗传特征，预后生存等等，且后期在落实”湿实验“时也有着得天独厚的优势，构建稳转细胞株，能够让基因表达对细胞表型或者行为学的影响一目了然。

但是单基因文章难就难在如何挑选“单基因”，好的基因无疑能够给文章增色不少，而且带有特色背景的基因，也更容易为研究提供极具指导性意义的研究方向。今天带大家来学习带有特殊背景的单基因泛癌文章，思路可复现。

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今天的主角大家也不陌生，作为RNA甲基化修饰的老员工甲基转移酶样蛋白METTL1已经被证明广泛参与肿瘤发展。文章主要就是研究METTL1对泛癌免疫和干细胞的综合分析，文章题目：A Comprehensive Analysis of METTL1 to Immunity and Stemness in Pan-Cancer。文章实在今年5月份发表在Front Immunol。

研究背景

METTL1位于染色体带12q13上，包含一个保守的S-腺苷甲硫氨酸结合基序，可以通过磷酸化的丧失而被激活。METTL1已被报道在多种癌症中异常表达，包括肝细胞癌、结肠癌、肝内胆管癌、肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、某些肉瘤和急性髓细胞性白血病，并与肿瘤的发生、转移有关,和化学敏感性表现出显著的相关性。最近的研究发现，转录后RNA修饰在肿瘤免疫微环境的形成中起着重要作用。

免疫疗法，也称为免疫检查点阻断(ICB)疗法，由于肿瘤免疫微环境的复杂性和免疫逃逸的影响，部分情况下免疫疗法的反应率有限。为了提高泛癌免疫治疗的有效性，深入研究免疫抑制性肿瘤微环境（TME）具有重要意义。

肿瘤细胞干性，称为从初始细胞自我更新和分化的能力，一般干性越高，肿瘤越容易发生远处转移和耐药。已有研究从多能干细胞及其分化后代中获得表观遗传和转录组特征生成干性指数，而这些干性指标可用于评估肿瘤去分化程度和患者的生存预后。

材料和方法

1）数据采集：TCGA数据库、IMvigor210队列、GEO数据库资料采集（GSE 67501和GSE 78220)、CCLE数据库。

2）METTL1表达鉴定：METTL1在泛癌临床特征中的表达和预后作用分析。

3）METTL1活性的产生：构建了METTL1基因特征，通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）计算METTL1活性。

4）基础实验1：细胞系和细胞培养，siRNA敲降，细胞增殖试验，Transwell检测。

5）METTL1与免疫的关系：ESTIMATE算法用于根据RNA序列图谱推断基质或免疫细胞浸润到肿瘤中的程度。

6）干度指数：使用OCLR基于从多个数据库获得的mRNA表达或DNA甲基化数据量化肿瘤干性。

7）METTL1表达或活性与干度的关系：Spearman相关分析METTL1表达或活性与肿瘤细胞自我更新潜力之间的关系。

8）METTL1表达的生物学意义：GSVA和GSEA分析METTL1在33种癌症中的生物学过程。

9）基础实验2：CCK-8用于评估细胞活力。

10）药物敏感性分析：Spearman相关分析药物敏感性和METTL1表达之间的关联。

结果展示

①泛癌中METTL1表达的临床概况：如图2A所示,METTL1在33种癌症中的UCEC、THYM、STAD、READ、PRAD、LIHC、LUAD、LUSC、KIRC、HNSC、GBM、ESCA、CHOL、COAD、BLCA和BRCA高于相应的正常组织，在PCPG和THCA中的表达较低。METTL1在BRCA、KIRC、LGG、OV、SARC和THCA的老年患者中显着高表达，而METTL1在CESC、ESCA、LIHC、LUAD以及LUSC组中的表达较弱（图2B）。此外，METTL1表达与某些癌症的肿瘤分期显着相关，例如KIRC、LIHC和STAD。（图2C）。更重要的是，末次随访时存活的患者在DLBC、KIRC、LGG、LIHC、OV和PCPG中的METTL1表达不同（图2D）。

②METTL1活性与临床特征之间的相关性：基于100个与泛癌中METTL1表达最相关的基因构建了METTL1基因特征。ssGSEA用于生成METTL1活性资料。结果显示，BLCA、UCEC、READ、THCA、STAD、PRAD、LUSC、LUAD、LIHC、ESCA、KIBP、KICH、KIRC、HNSC、GBM、CESC、CHOL、COAD以及BRCA肿瘤组中METTL1活性显着升高（图3A）。如图3B-D显示在部分肿瘤中METTL1活性与年龄、肿瘤分期、性别、存活率和治疗的结果表现住显著关联性。

③METTL1在泛癌中的预后预测功能：基于森林图绘制，ACC、MESO、KIRC、LGG、LIHC和SARC中OS和METTL1表达之间存在明显的正相关关系，而DLBC和PCPG中发现了负相关（图4）。关于METTL1表达和DFS，在CHOL、LGG、LIHC和PRAD中观察到显着的正相关（图4）。DSS中，METTL1表达在OV和PCPG中具有有利影响，但是在ACC、KIRC、LGG、LIHC、MESO、THCA以及THYM中表现为危险因素（图4）。此外，在PFS森林图中，METTL1表达被认为是ACC、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、MESO和PRAD中的一个危险因素（图4)。

④METTL1对肿瘤进展的影响：蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析METTL1和前十个候选蛋白质的相关性网络(图5A)。结果显示，所有这些蛋白质在转录后RNA修饰过程中都至关重要。

考虑到METTL1与KIRC、LGG和LIHC之间的强相关性，使用GSEA研究了METTL1信号在泛癌中的潜在通路。图5B-D表明来自增殖和转移相关通路的基因组，包含E2F、JAK-STAT和上皮间质转化信号通路，更喜欢在KIRC、LGG和LIHC的高METTL1病例中富集。

在U251中敲低和过表达METTL1，发现METTL1的下调导致EdU阳性细胞百分比显着降低，而METTL1的过表达增加了EdU阳性细胞百分比（图5E-G）。

⑤免疫相关因素与METTL1之间的关联：图6A中METTL1表达与SARC基质评分呈正相关，与KIRP、LGG、PCPG、SARC和TGCT免疫评分呈正相关。而在HNSC中，METTL1表达与基质评分、免疫评分以及ESTIMATE评分呈正相关。此外，M2巨噬细胞浸润与HNSC中的METTL1表达呈正相关（图6B）。METTL1表达与BRCA、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、PRAD和SARC中免疫细胞浸润的调节性T细胞含量呈正相关（图6B）。在TGCT中，METTL1表达与静息肥大细胞、M2巨噬细胞和M0巨噬细胞浸润呈负相关，但与活化记忆CD4+T细胞、滤泡辅助T细胞、CD8 T细胞和幼稚B细胞浸润呈正相关（图6B）

⑥METTL1表达在ICB治疗中的作用：雷达图分别可视化METTL1表达与STAD、PRAD、LUAD、LUSC、LIHC、LGG、KICH、KIRC HNSC和BRCA中的肿瘤突变负荷(TMB)呈正相关关系，而在COAD和THCA中发现负相关（图7A）。对于微卫星不稳定性(MSI)，确定了BLCA、DLBC、HNSC、KICH、KIBP、MESO、PRAD、SKCM、STAD和THCA的正相关，以及COAD、LAML和TGCT的负相关（图7B）。此外，图7C表明METTL1表达与THCA、SARC、STAD、SKCM、PRAD、OV、LGG、LAML、KIRC、KIBP、HNSC、COAD、CESC和BRCA中的CD274呈负相关，而在TGCA中呈正相关。

⑦METTL1表达与PD-1/L1阻滞剂对ICB治疗反应之间的相关性：考虑到METTL1表达似乎与TME相关，引入三个免疫治疗队列、两个抗PD-1队列（GSE 67501；GSE 78220）和一个抗PD-L1队列（IMvigor210）。IMvigor210队列中的患者对抗PD-L1阻滞剂表现出不同程度的反应，包括疾病稳定（SD）、疾病进展（PD）、部分反应（PR）以及完全反应（CR）。响应组中的METTL1表达显着高于无响应/有限响应组（图7D）。另外发现METTL1高表达的患者新抗原负担高，认为对ICB治疗的反应更好（图7E）。然而，METTL1表达与存活之间的关联并不明显（图7F）。

⑧METTL1表达的潜在治疗价值：GDSC数据库用于确定与METTL1表达和药物敏感性相关的药物（图8A）。此外，分析了上述药物靶向的信号通路。敏感性与METTL1高表达相关的药物主要针对染色质组蛋白甲基化、ERK-MAPK和WNT信号通路。相反，敏感性与低METTL1表达相关的药物靶向细胞周期、细胞凋亡、蛋白质稳定性和降解信号通路（图8B）。暗示METTL1很可能成为设计有效治疗策略的潜在生物标志物。

在A172细胞中METTL1表达最低，而U118MG的METTL1表达最高（图8C）。经过CCK-8测定表明，高METTL1表达的U118MG细胞对染色质组蛋白甲基化抑制剂EPZ5676和ERK-MAPK抑制剂Ulixertinib更加敏感（图8D，E）