学思路：8分肿瘤微环境单细胞亚群特征基因分析

单细胞测序技术的发展，可以我们从单个细胞的视角重新审核各类疾病的病理机制，以及疾病中不同细胞的之间的相互作用。今天给大家介绍一篇基于单细胞细胞亚群注释，解析三阴性乳腺癌肿瘤微环境中与巨噬细胞极化相关的关键基因，以及关键基因在三阴性乳腺癌中预后和相关性分析。

今天给大家带来一篇单细胞干湿结合的文章思路，标题：Mapping the Tumor Microenvironment in TNBC and Deep Exploration for M1 Macrophages-Associated Prognostic Genes。这项研究本基于公共数据库、scRNA-seq 和批量 RNA-seq 数据研究了 TNBC 的肿瘤和免疫微环境异质性。分析IFI35、PSMB9 和 SAMD9L 在内的三个 maker 基因与 M1 巨噬细胞的密切联系。最终认为，IFI35 可能是一个有前途的新靶点，有助于将巨噬细胞极化重塑为 M1 亚型以发挥抗肿瘤作用。文章是2022年6月发表在Frontiers in Immunology。

【摘要】

由于高度异质性和缺乏有效的治疗靶点，三阴性乳腺癌 (TNBC) 仍然是最差的分子亚型。在这里，我们使用来自公共数据库和我们队列的 scRNA-seq 和批量 RNA-seq 数据研究了 TNBC 的肿瘤和免疫微环境异质性。巨噬细胞亚群在肿瘤免疫微环境 (TIME) 中占很大比例，而 M1 巨噬细胞与更好的临床结果相关。此外，包括 IFI35、PSMB9 和 SAMD9L 在内的三个 maker 基因显示出与 M1 巨噬细胞的密切联系。具体来说，IFI35 与巨噬细胞活化、趋化性和迁移呈正相关。此外，IFI35 高表达的患者预后较好。体外随后的研究表明，IFI35 在巨噬细胞的 M1 亚型分化过程中被上调。总之，我们的数据表明，IFI35 可能是一个有前途的新靶点，有助于将巨噬细胞极化重塑为 M1 亚型以发挥抗肿瘤作用。

【研究机制】

【核心结果】

干分析

1、单细胞群图注释：首先基于 scRNA-seq 分析探索了 TNBC 的肿瘤内和肿瘤间异质性，成功注释了 12 个细胞簇。为了进一步探索肿瘤异质性，将上皮细胞分为总共11种恶性细胞亚型。有趣的是，即使在同一肿瘤类型中肿瘤细胞具有广泛而明显的异质性。为了更有效地证明肿瘤内部和肿瘤之间存在异质性，描绘了每个患者肿瘤中不同细胞亚群的组成比。患者CID44041包含了75%的簇7，这是极为少见的分型。此外，患者 CID44971 主要拥有集群 1，患者 CID44991 集群 5，患者 CID4513 和 CID4515 集群 0。也就进一步证实了，病例之间同时存在肿瘤内和肿瘤间异质性。使用 inferCNV探索各种肿瘤细胞亚型的基因组拷贝数变化。簇4在12号染色体上显示出较高的CNV，而簇2在6号染色体上具有较高的CNV。可见肿瘤内部的异质性不仅体现在组成成分上，还体现在基因突变的形式上。

2、肿瘤免疫微环境的复杂性和异质性：为了研究肿瘤免疫微环境（TIME）的复杂性和可变性，引入经典标记确定了八个免疫细胞簇，包括 B 细胞、CD4 + T 辅助细胞、CD4 + Treg 细胞、细胞毒性 CD8 + T 细胞、NK 细胞、中性粒细胞和 M1 和M2 巨噬细胞。使用 SingleR 和规范标记的组合方法在不同的细胞簇中鉴定了标记基因。经典的免疫抑制细胞由 CD4 + Treg 细胞（FOXP3 和 CTLA4）和 M2 巨噬细胞（CD163 和 VSIG4）组成。我们进一步估计了每个患者中每个免疫细胞亚群的比例，发现不同TNBC患者的免疫细胞组成存在明显的异质性。此外，免疫细胞的分化轨迹是由伪时间构建的，伪时间是衡量单个细胞在细胞分化过程中取得多少进展的指标。基于这一分化轨迹，说明髓系免疫细胞和淋巴系免疫细胞是分开分化的，免疫细胞的分化轨迹是多变的。

3、巨噬细胞在肿瘤免疫微环境中的意义：研究中纳入scRNA-seq 分析的样本量有限，进一步引用来自 FUSCC 和 TCGA TNBC 队列的大量 RNA 测序来进一步剖析 TIME。“CIBERSORT”包用于评估来自 360 名 FUSCC 和 158 名 TNBC 患者的各种免疫细胞的浸润，巨噬细胞在所有 22 种免疫细胞中占非常高的比例，与 scRNA-seq 结果一致。这一结果再次强调了巨噬细胞在 TIME 中的重要作用。结合每个患者的免疫细胞比例，肿瘤间的异质性在TIME内普遍存在的。为了进一步探讨不同免疫细胞浸润对患者预后的影响，我们根据“CIBERSORT”软件包估算的免疫细胞浸润评分将患者分为高低浸润组，共 22 种免疫细胞类型。生存分析显示 FUSCC 队列中五种免疫细胞亚型与患者的预后相关，TCGA 队列确定了七种与预后结果相关的免疫细胞亚群。总结巨噬细胞亚群占TIME的比例很高，并且与患者的预后有关。

4、高和低巨噬细胞浸润之间的突变景观：一般来说，巨噬细胞可以被诱导成M1抗肿瘤或M2促肿瘤表型。TIME中的巨噬细胞遵循着动态进化过程。为了专注于 M1 巨噬细胞引发抗肿瘤免疫。进一步分析M1 高和低巨噬细胞浸润组之间的突变情况。首先确定了前 20 个突变基因，其中最突出的变异是 TP53（在 74% 或 77% 的肿瘤中发现），其次是 PIK3CA（16% 或 20%）和 TTN（16 % 或 14%）。其中只有 9 个基因有共同突变，包括 TP53、PIK3CA、TTN、MUC16、KMT2C、OBSCN、PTEN、RYR2 和 DNAH9。此外，PTEN 和 MUC16 在 M1 低浸润队列中明显共突变，但在 M1 高浸润队列中没有。以上数据表明，在 TNBC 中，M1 高浸润和低浸润患者队列之间存在不同的突变情况。

5、与 M1 巨噬细胞浸润相关的关键标记基因：WGCNA 用于构建无标度网络，以识别与 M1 或 M2 巨噬细胞浸润相关的关键标记基因。从 FUSCC 和 TCGA TNBC 队列中识别 FUSCC 中浅青色模块以及 TCGA中的浅黄色与较高的 M1 巨噬细胞浸润相关。进一步计算M1 巨噬细胞的模块成员资格与基因显着性之间的相关性。两个模块都显示出与 M1 巨噬细胞的高度相关性。评估两个模块中每个基因的连通性。从两个模块中取top30 hub基因仅在存在22个重合基因，包括IFIT3、IFI35、OAS2、PSMB9、SAMD9L等。

6、与 M1 浸润相关的三个典型基因与更好的预后相关：比较M1 高和低巨噬细胞浸润组之间 22 个基因的表达差异，来自 FUSCC 和 TCGA 数据集的 M1 高巨噬细胞浸润组中均显示为表达较高，但是只有 IFI35、PSMB9 和 SAMD9L 三个代表性基因在 FUSCC 和 TCGA 队列的生存分析中得出了一致的结论。而且IFI35、PSMB9 和 SAMD9L 的高表达显示与更好的预后相关。也就能说明具有较高 M1 巨噬细胞的患者生存期延长。

7、探索 IFI35、PSMB9 和 SAMD9L 和 M1 巨噬细胞之间的关系：首先计算这三个基因与 M1 巨噬细胞浸润评分之间的相关性，结果显示所有基因均与M1巨噬细胞浸润呈正相关。从 GSEA 数据集中提取了三个经典的巨噬细胞活化、趋化性和迁移基因组，并分析了它们与 IFI35、PSMB9 和 SAMD9L 表达之间的关系。先前的一项研究使用体内巨噬细胞激活模型来预测巨噬细胞程序，并确定了 49 个基因模块，因此研究进一步探讨了 IFI35、PSMB9 和 SAMD9L 的高表达是否与这些模块相关。结果显示，大约 50% 的基因组富含这三个基因的高表达。因此，三个与巨噬细胞向 M1 亚型极化密切相关的基因。

湿实验

8、巨噬细胞的 M1 极化上调 IFI35 表达：为了确认生物信息学分析的结果，我们选择了三个标记基因之一进行进一步验证。基于 scRNA-seq 数据，IFI35 主要以髓源性细胞为主，包括中性粒细胞、M1 和 M2 巨噬细胞。在人类 M0、M1 和 M2 巨噬细胞的转录组分析中，M1 巨噬细胞的 IFI35 表达高于 M2 巨噬细胞。针对不同的刺激，M0巨噬细胞基于IDO1、IL-1α、IL- 1β、IL-6、TNF-α、CD80 和 MHC II，以及 M2，例如 ARG1、IL-10、CD163 和 CD206。显然，IFI35 在 RNA 和蛋白质水平上均上调。同时，IFI35在M1巨噬细胞的细胞质和细胞核中表达，在细胞形态上表现出细胞伸长。组织学上，CD86高表达的M1巨噬细胞表现出IFI35表达，也直接反映了IFI35与M1亚型巨噬细胞之间的密切联系。

【总结】

以PD-1/PD-L1为代表的免疫检查点抑制剂（ICBs）获批，抗肿瘤治疗进入免疫治疗新时代。巨噬细胞作为TIME中最丰富的免疫细胞亚群，单纯以细胞耗竭的方式只会给个体组织带来一系列损害组织稳态的副作用，因此探索调节TAMs 复极化的新分子靶点是癌症免疫治疗的一个有吸引力的方向。本研究通过生物信息学分析探讨了 TNBC 中 IFI35 表达与 M1 浸润之间的正相关关系。分析IFI35对于巨噬细胞M1亚型分化的作用，证明IFI35在TIME发挥促炎和抗肿瘤作用。综上所述，IFI35有助于重塑巨噬细胞极化以实现抗肿瘤作用。