结直肠癌（CRC）靶向治疗乏善可陈，需要对其生物学特性深入了解才可能发展新的治疗策略。上皮-间充质转化（EMT）指上皮细胞获得间充质表型的细胞重编程过程，EMT激活后发生的系列变化，有助于肿瘤细胞扩散、侵袭周围组织和远处转移。EMT在CRC转移进展和耐药中发挥重要作用，越来越多研究表明EMT标志物可作为CRC的预后预测指标和潜在治疗靶点。本文描述了EMT的基本过程，可靶向的EMT标志物和相关药物，探讨了靶向EMT治疗面临的困难。
EMT相关改变
EMT是多个具有共同特征过程的总和，发生多层面、可逆、涉及细胞生物学、基因表达和生理学的系列变化。证据显示，细胞重编程包括完全EMT、完全间充质上皮转化（MET）、上皮特征不完全抑制和间充质特征不完全获得，后二者称为部分EMT，部分EMT肿瘤具有较高转移潜能，其中以上皮特征较多、间充质转化较少的亚群恶性程度和转移潜能最高（图1）。
1. 细胞改变
典型EMT细胞通过改变细胞外基质增加运动性和迁移能力，表现为上皮细胞间连接溶解、基底膜完整性受损、细胞极性改变和细胞骨架重排，从主要表达角蛋白转变为表达vimentin，典型的多边形、鹅卵石样上皮细胞外观丧失，呈现梭形纤维细胞样外观并表达间充质细胞标志物（如N-Cadherin、vimentin和fibronectin）和基质金属蛋白酶活性。
2.遗传学改变
发现多个参与EMT调节的重要因子的转录因子，如Snail （SNAI1）、Slug （SNAI2）、Zeb1（TCF8）、Zeb2和Twist，还发现了一些参与或受EMT基因调控或影响EMT编程的microRNAs和非编码RNAs。抗癌管家-康爱管家，我们一起抗癌，治愈癌症不是梦。microRNA-200 （miR-200）家族和miR-34家族研究最多（图1），miR-200c抑制Zeb1表达，从而抑制CRC迁移和侵袭。明确这些相互作用引起的变化可更好地理解CRC的EMT。
图1. CRC的MET和EMT概略
3.生理改变
EMT和CRC获得干细胞样特征相关，推测CRC中频繁表达的CD51是干细胞标志物；TGFβ1处理后的CRC瘤球大量表达CD44和SOX2，并使得肿瘤相对耐药、免疫检查点蛋白上调、规避免疫细胞或药物的细胞毒性；干细胞样耐药由药物转运泵上调、细胞静默、DNA修复能力增强、多药耐药基因过表达和抗凋亡机制介导；激活EMT可促进TGF-β1释放，增加免疫抑制性调节T细胞，抑制CD8+细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞，降低免疫治疗反应；EMT增加肿瘤表达PD-L1，通过与PD-1相互作用降低细胞毒性T细胞作用，对检查点阻断治疗耐药，加剧免疫逃避（图2）。
4.代谢改变
癌细胞可重编程代谢循环，以满足EMT生物能量需求。诱导EMT的信号、转录因子和长链非编码RNA可增强糖酵解和脂肪酸氧化，抑制氧化磷酸化，而抑制EMT的microRNA通过调节代谢产物转运体和代谢酶表达，抑制糖酵解和脂肪酸氧化（图2）。这些异常调节对EMT影响巨大。
EMT需要高度调控和协调以确保基因在空间和时间上正确激活。已证实多个因子与致癌EMT相关，包括EMT诱导剂、EMT调节剂和EMT效应剂（图3）。
1.EMT诱导剂
最著名的CRC诱导剂是Wnt/β-catenin信号通路,激活后β-catenin只能停留在胞质，无法核内积累；上调Snail（EMT的核心调节因子），抑制E-Cadherin，促进迁移和局部侵袭，增强Wnt靶基因表达；增强的Wnt信号抑制GSK3β，使得Slug不被 GSK3β磷酸化和β- TrCP介导的泛素化破坏。Snail和Slug累积抑制E-Cadherin是EMT的主要标志。
TGF-β信号在癌症早期具有稳定肿瘤的作用，在晚期肿瘤的作用相反。典型TGF-β信号包括I型和II型受体丝氨酸-苏氨酸激酶与配体结合后的异源二聚化，通过Smad蛋白磷酸化传递信号，与Smad2、Smad3、Smad4及其他转录因子协同促进诱导EMT的基因转录。TGF-β还可通过RhoA介导的独立Smad4途径诱导EMT。
Notch信号网络主要通过Notch1诱导Jagged1上调，参与CRC的EMT。Notch受体如Notch3激活后，增加CD44、Slug和Smad3表达，参与EMT。RAS信号通路主要包括丝裂原激活蛋白激酶和磷酸肌苷-3激酶途径。这二条途径主要由受体酪氨酸激酶激活，也受TGF-β介导的独立Smad4途径的信号影响，最终激活转录因子，如NF-κB和Snail，促进EMT。
2.EMT调节剂
调控EMT的转录机制包括Snail、Zeb和Twist家族。Snail家族的锌指转录因子与E-box结合基序结合，Snail2（Slug）与之相同。Slug与Snail能抑制E-Cadherin表达，与多种途径协同激活间充质基因表达，如vimentin、N-Cadherin和fibronectin。Slug过表达也可诱导其他EMT调控因子，如Zeb1和Zeb2。
Zeb1和Zeb2在CRC中经常上调，通过直接结合E-Cadherin启动子区域的E-box或通过招募共抑制因子C端结合蛋白调控EMT，导致E-Cadherin表达下调；Zeb1还可沉默上皮基底膜成分LAMA3，导致基底膜缺失；上调Zeb1可激活LAMC2和尿激酶纤溶酶原激活因子等间充质基因的表达，促进肿瘤侵袭；Zeb2基因过表达也可激活其他EMT蛋白，如基质金属蛋白酶9和Twist。
研究表明，Twist1和Twist2在多种癌症中过表达，激活N-Cadherin启动子，启动间充质标志物表达，如N-Cadherin和fibronectin，导致E-Cadherin介导的细胞间粘附丧失，促进EMT。
3.EMT效应剂
EMT转录因子基因水平激活后，EMT的发生还需要完成二件事：上皮粘附蛋白E-Cadherin和连接蛋白（如occludin和claudin）下调，细胞粘附不稳定；间充质蛋白表达增加（如N-Cadherin、vimentin和fibronectin），驱动细胞运动和侵袭功能。
Vimentin是细胞骨架蛋白，也是CRC的EMT指标，主要表达于间充质细胞，有助于保持细胞完整性，赋予细胞耐药性，促进细胞迁移。因此，vimentin表达增加促进CRC的侵袭。
Fibronectin是细胞外基质糖蛋白，负责间充质细胞粘附和迁移。证据表明，fibronectin与CRC发病相关，fibronectin升高与CRC预后差密切相关。研究显示，CRC的fibronectin附加结构域A通过与α9β1整合素相互作用促进癌细胞EMT，并最终导致Snail和vimentin上调，降低E-Cadherin。
EMT标志物的预后作用
分子分型和基因分型越来越多地用于肿瘤分层，预测性标志物可指导特定的治疗，预后性标志物可指导肿瘤治疗强度。数据表明，个体化的EMT标志物（如E-Cadherin缺失和vimentin过表达）可作为CRC治疗和生存的预测因子。联合分析多个CRC标志物改变，如E-Cadherin、β-catenin、vimentin、Snail和CD133，与无病生存和总生存具有更强相关性。一项纵向研究显示，EMT标志物联合能改善预后能力，避免了单因素分析所致误判。
CRC共识分子分型（CMS）包括CMS1、2、3和4，其中CMS4（23%间充质）有显著的TGF激活、间质侵犯和血管生成。CMS4 CRC具有EMT特征，通过Zeb1和Zeb2，肿瘤抑制性的microRNA明显减少，并与基质重塑和TGF-β特征相关，合理解释了为什么CMS4预后最差。
液体活检的EMT特征是另一有前景的预后指标。CRC患者的循环肿瘤细胞存在上皮和间充质杂合的EMT特征时，转移可能性增加，生存较差，同时还可作为治疗反应指标。循环肿瘤细胞是通过上皮细胞粘附分子（EpCAM）技术进行分离，EpCAM缺失时部分肿瘤细胞亚群无法检测到，联合分析上皮和间充质细胞标志物可解决这一问题，并能更好的预后判断。
EMT作为治疗靶点
靶向EMT诱导剂、调节剂或效应剂极具挑战性，因为途径的可塑性和异质性，而且途径间的溢出效应也会影响靶向EMT的治疗。由于多个冗余途径，靶向单一EMT受体不太可能奏效，但靶向上游转录因子可能会产生明显的表型效应。由于EMT转化细胞生物学特性的改变，如细胞流动性、侵袭性、转移性和耐药性增加，使得研究更为复杂。抑制EMT可采取三种策略：与传统抗癌药物联合，克服晚期疾病耐药性，不过化疗虽是CRC治疗的关键，但耐药不可避免；抑制EMT的药物用作辅助治疗，减少转移性疾病切除后的复发；安全性有保证前提下，EMT抑制剂作为化学预防药物使用，但最难实现。
1.靶向诱导剂
几种靶向TGF-β的治疗正在研究中，其中小分子抑制剂备受关注。Galunisertib（LY2157299）是口服TGF-βI型受体激酶小分子抑制剂，特异性下调Smad2磷酸化，终止TGF-β通路激活。LY2109761是TGF-β I型和II型受体的双激酶抑制剂，抑制CRC细胞中TGF-β介导的Smad和非Smad通路激活，降低细胞迁移、侵袭和致瘤性。多肽P17和P144显著降低TGF-β1诱导的CRC小鼠肝转移。一些天然化合物也有抑制TGF-β的作用，体外实验中白藜芦醇通过抑制TGF-β1诱导的EMT，降低CRC模型的肝肺转移。靶向TGF-β的单克隆抗体fresolimumab，可中和所有TGF-β亚型,纳入28例恶性黑色素瘤和肾细胞癌的1期研究中，1例恶性黑色素瘤部分缓解，6例疾病稳定，无进展生存24周，未发生药物相关的4/5级不良事件。
反义寡核苷酸是短的（13-25个核苷酸）单链序列，与目标mRNA序列互补结合，可阻断蛋白翻译。Trabedersen与TGF-β2 mRNA特异性结合，治疗IV期胰腺癌、恶性黑色素瘤、CRC和脑癌，初步疗效令人鼓舞。但trabedersen在胶质母细胞瘤和间变星形细胞瘤中未显示明显的抗肿瘤作用。
瑞戈非尼是口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂，靶向BRAF、VEGFR-1/2/3、KIT、TIE-2、PDGFR-β、FGFR-1、RET和RAF-1，是转移性CRC的三线治疗。研究发现，瑞戈非尼能激活蛋白酪氨酸磷酸酶家族的SHP-1，消除EMT诱导的CRC侵袭和转移。
塞来昔布是选择性COX-2抑制剂，可抵抗CRC细胞株中的EMT改变，如缺氧或表皮生长因子诱导的β-catenin胞内定位以及vimentin和E-Cadherin浓度改变。但另一COX-2抑制剂罗非昔布辅助治疗CRC未能改善总生存和减少复发。
Cabozantinib是多激酶抑制剂，靶向VEGFR2、MET、FLT3、c-Kit和AXL。敲除AXL可减少CRC细胞迁移和侵袭，源于下调EMT所需转录因子（Slug、Twist和Zeb1），增加E-Cadherin表达。一项临床研究中cabozantinib联合帕尼单抗治疗KRAS野生型CRC，客观缓解率16%。
２.靶向调节剂
转录控制着增殖、侵袭和迁移，因此靶向EMT调节剂极具吸引力，但相关药物非常少，因为转录发生于核内，药物不易进入。
３.靶向效应剂
E-Cadherin缺失是EMT的重要特征，恢复其表达抑制转移是有前景的方法。CRC细胞株甲氨蝶呤处理后，E-Cadherin表达是初始值的10倍，虽然结果还需进一步验证，抗癌管家-康爱管家，我们一起抗癌，治愈癌症不是梦。但也提示辅助化疗后低剂量甲氨蝶呤维持治疗预防转移是可考虑的治疗策略。同样，CD133+CRC细胞中，salinomycin下调vimentin表达，上调E-Cadherin表达，逆转阿霉素诱导的EMT，恢复肝细胞癌异种移植的化疗敏感性，值得进一步研究。
此外还可通过反向MET程序逆转EMT。数据表明，激活人乳腺上皮细胞的MET可降低侵袭性，增加瘤球形成和药物治疗敏感性。然而实现上述治疗需要克服许多障碍，如失活EMT和诱导MET可促进肿瘤转移定植和远处生长，因此反向MET治疗可能会加速肿瘤播散，所以要仔细圈定治疗时间。
除了直接靶向EMT，还可通过药物间接影响EMT状态。代谢重编程促进癌细胞EMT表型转换获得广泛关注，Ramesh等公布了具有EMT抑制作用的药物列表，其中许多药物已用于癌症和其他疾病，毒性和疗效均可接受，值得进一步研究。
讨论
EMT编程需要细胞信号通路中多个调节因素协同才能完成，研究表明，驱动EMT的因素可作为预后标志物或开发药物靶点。然而将这些临床前或早期临床结果转化为常规实践极具挑战，如潜在的脱靶毒性；EMT调控网络中有大量的交叉和替代途径，使得发现好的药物靶点非常困难；干扰TGF-β信号通路预防EMT需要平衡TGF-β在CRC中的双重作用，即既要抑制TGF-β信号通路的促瘤特性又不损害其在早期CRC中的抑癌功能。
临床前模型并不能真正代表临床癌症，不能完全再现肿瘤异质性以及EMT短暂可逆的可塑性。EMT国际协会的2020年共识旨在为EMT研究提供指导。此外，通过整合代谢、蛋白质组学和基因方法建立可靠有效的EMT（特别是部分EMT）标志物非常重要，它是预后和EMT抑制剂进入临床的前提。
