张庆玲教授：DNA+RNA双检助力肿瘤结构变异检测_

精准医学时代背景下，以高通量测序（NGS）技术为代表的精准检测方法已从科研实验室走入临床病理科，并在肿瘤遗传易感检测、伴随诊断、疗效评估及预后监测等领域发挥重要作用。

和瑞基因【精准实验室大师班】旨为全国病理、肿瘤医生提供一个肿瘤病理相关的学术交流平台，分享分子病理与精准医疗相关的前沿理论和技术进展，探索NGS临床应用，从而更好地服务于临床诊治，使患者获益。

本期和瑞基因【精准实验室大师班】邀请到广东省人民医院病理科主任张庆玲教授，请张教授讲解“DNA+RNA双检助力肿瘤结构变异检测”相关话题。

1. 融合已成为重要靶点

融合基因是由两个或多个基因的编码区相连，置于同一套调控序列的控制下而构成的嵌合基因。融合基因是肿瘤驱动基因重要类型之一，且发生于多种实体肿瘤。

Cell期刊上发表的TCGA泛癌种大样本基因融合分析显示：16.5%的患者检测到基因融合，且其中1.8%仅检测到融合基因；6%的患者存在用药相关融合，其中肺腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌等癌种融合频率较高；4.8%的肺腺癌患者存在用药相关融合；不吸烟肺腺癌患者的融合频率显著高于吸烟患者[1]。

同时，随着融合靶点及相关靶向药物的逐年增加，融合基因检测在临床也越来越受到关注。包括ALK、ROS1、RET 、NTRK等基因在内的多种融合基因检测已纳入非小细胞肺癌（NSCLC）相关指南或共识中被常规推荐，如《中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识》《ROS1阳性非小细胞肺癌诊断病理专家共识》等。

基于融合靶点的治疗已占据非小细胞肺癌的“半壁江山”。在非小细胞肺癌NCCN指南中，推荐肺癌患者应检测的8个靶点中，就包含了4个融合基因，包括ALK、ROS1、NTRK1/2/3、RET。

2. 融合检测存在诸多挑战

精准诊疗，检测先行。精准的融合基因检测对于癌症患者的变异类型诊断至关重要。目前临床常用的融合基因检测方法较为多样，包括荧光原位杂交（FISH）、免疫组化（IHC）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和NGS等，这些检测方法各具优劣势。

FISH的特点在于可以直观地看见融合基因的有无，其缺点在于检测过程耗时较长、成本高，且对操作和判读技术要求较高。从检测结果来看，FISH融合基因检测不能明确具体的融合类型，且对罕见的、复杂的重排可能发生漏检。

RT-PCR的特点在于快速、价格低。由于其是通过将RNA在逆转录酶和特异性引物作用下逆转录成ctDNA，然后设计探针对基因融合位点进行检测，所以只能检测已知的融合基因类型，不能检测未知的融合基因类型。抗癌管家-康爱管家，我们一起抗癌，治愈癌症不是梦。由于断点位置的复杂性，有时也会出现一些漏检。

IHC的优势在于快速，一天就可以出具报告，且价格便宜。但其灵敏度会根据不同的抗体有所区别，且IHC是基于形态学观察，对结果的判读具有一定的主观性。

基因融合复杂多变，传统检测方法存在各种局限性。随着NGS技术的快速发展，融合检测迎来了新的机遇。NGS技术可以在DNA及RNA层面一次检测多种基因和多种融合变异，有效检出已知和未知的融合基因类型，弥补常规检测方法存在的漏检或不能明确融合伴侣基因等不足。但其缺点在于，相对传统检测方法而言价格较高，且检测数据出来后需要进一步的生信分析及医学解读，对检测单位的技术实力有更高的要求。

基于NGS的融合基因检测，按照检测模板的不同，可以分为DNA-based NGS和RNA-based NGS。在DNA水平上，基因融合断裂位点多在内含子，且断裂位置不确定，因此DNA-based NGS检测融合基因不可避免存在以下挑战：①有些探针如果不能覆盖全面，特别是只基于已知突变设计的一些探针，可能会出现漏检；②内含子区域存在重复序列，探针设计难度高，检测时可能无法比对到基因组上的唯一序列，这时就需要检测机构有较高的生信算法能力，否则会影响检测结果的准确性；③一些融合仅发生在RNA层面，或者是DNA层面融合丰度很低，单DNA水平检测可能会发生漏检；④DNA层面融合非常复杂，如三基因融合、基因间区融合，可能存在阻碍捕获的复杂序列，从而导致漏检。

因此，相关NCCN指南中也明确推荐RNA检测以提升融合检出。如对于DNA水平融合检测难度较高的NTRK1/3等融合基因，推荐RNA检测优于DNA检测；广泛的基因检测未发现有肿瘤驱动基因的患者，特别是从不吸烟的患者，建议使用基于RNA为模板的NGS Panel进行检测，从而更大程度检出融合事件，避免漏检。

来自于真实世界的研究进一步证实了RNA检测可以有效提升融合的检出率。2019年发表在《Clinical Cancer Research》的一篇文章显示，RNA-based NGS检测融合、易位较DNA-based NGS提升5%-15%的检出率[2]。MSKCC的一项研究也表明，DNA大Panel检测驱动基因变异为阴性的232例患者，经RNA-based NGS又额外检测到了36例常见可治疗的融合变异，融合检出率提升了14.2%[3]。

RNA-based NGS检测不仅可以提升融合变异的检测准确性，还能够确认融合的有效性。DNA水平发生的复杂融合事件是否能够在RNA水平形成融合产物？这需要进一步确认。如果发生在DNA水平的融合不能形成融合产物，意味着它可能不是形成肿瘤的驱动性突变基因。通过RNA-based NGS的验证，可以进一步明确融合与肿瘤发生发展的相关性，从而更加精准的指导临床诊疗。

单DNA检测并非完美，但单RNA 检测也存在明显不足。临床实际操作中，RNA样本较DNA更易降解，对保存条件要求更高，因此应用中受到一定的限制。如果RNA样本处理工作没有做好，发生了RNA降解，可能会造成检测结果的假阴性。且RNA-based NGS也存在发现不了部分复杂融合区域信息的问题，如基因间区（IGR）和非编码区域。

3. DNA+RNA双检助力融合精准检测

单DNA或单RNA检测均有局限，如何更有效、更精准进行融合检测？这是临床所思考的重要问题。九江市第三人民医院发表的研究中，通过和瑞基因RNA融合基因检测Panel发现一种新的ROS1基因融合现象——MPRIP-ROS1，患者接受酪氨酸激酶抑制剂治疗后，明显获益，无进展生存超过25个月，目前仍然在随访中。

来自郑州大学第一附属医院的另一项研究中也证实：DNA+RNA融合双检可解析复杂融合，助力临床决策，使患者获益。该研究在非小细胞肺癌中精准识别了14例复杂ALK重排，并成功识别出基因间复杂重排、基因内复杂重排和“桥接”重排3类复杂ALK重排。且通过RNA-NGS技术证实这些DNA水平上的复杂ALK重排转录后均表达典型的EML4-ALK融合蛋白。

此外，浙江大学医学院附属邵逸夫医院报道的一例晚期肺腺癌患者，也通过和瑞基因DNA+RNA双重检测实现了生存获益。同时，该报道还确认了全新SLC8A1-ALK融合的转录有效性及对ALK抑制剂的响应，鉴定了全新的ALK融合现象。

4. DNA+RNA双检

助力MET ex14跳跃突变检测

近年来，针对MET ex14跳跃突变靶点的药物研究持续发展，获批药物及在研药物数量迅速增加，患者的治疗情况获得显著改善。MET ex14跳跃突变已成为临床较为关注的“明星变异”。

MET ex14 跳跃突变是由MET基因突变导致的特殊结构变异。MET ex14 跳跃突变会使近膜结构域改变，进而造成MET蛋白泛素化功能障碍以及降解率减低，增加MET的稳定性，从而引起下游信号的持续激活，最终导致肿瘤的生长和发展。

MET ex14 跳跃突变并不是单一的“热点突变”，诸多研究表明，MET ex14跳跃突变方式包括碱基置换和插入缺失，因此突变类型和位置的多样化等给 MET ex14跳跃突变的检测带来了诸多挑战。抗癌管家-康爱管家，我们一起抗癌，治愈癌症不是梦。一项包含77例肿瘤患者采用DNA-based NGS及RNA-based NGS方法的研究发现，经RNA-based NGS检测为MET ex14跳跃突变的样本中，其中18.75%未能被DNA-based NGS检出[4]。

另一项含有422例肿瘤患者的更大样本研究的数据显示，对非小细胞肺癌患者，如果使用RNA-based NGS检测，补充DNA-based NGS检测，可以使MET外显子14跳跃突变的样本检出率提高37.5%[5]。此两项研究充分说明：DNA+RNA可以克服单DNA或RNA检测的不足，助力提升MET ex14跳跃突变精准检测，节省样本和时间的同时，使患者有更多的获益。

立足临床需求，坚持技术创新，解决融合检测难题

和瑞基因自2017年起一直致力于开发更优的融合变异检测技术和产品，针对融合检测制定三大优化策略，有效提高融合检出率及可靠性，避免漏检错检。

◆ 采用DNA+RNA双重检测，结合自主研发的SV Scan技术（一种结构变异的检测方法，专利申请号202010098320.0），能实现融合及MET 14号外显子跳跃等结构变异的高准确度检测。

◆ 增加探针覆盖范围和密度：增加伴侣基因探针覆盖并设计叠瓦式2-3X探针覆盖。

◆ 优化捕获策略，提高重复区覆盖率

◆ 通过多重策略的优化，最终实现无论DNA层面还是DNA+RNA层面，融合检测都更精准。

在多重融合检测策略支撑下，和瑞基因开发有多款肿瘤基因检测产品，可实现包括融合在内的基因融合/重排、易位的高精准检测。